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1.漂洗液：RW/Wash 首次使用按要求加无水乙醇并标记；不加乙醇会造成 RNA 纯度差，下游 PCR 失败。
2.试剂防护：裂解液、去蛋白液等含刺激性胍盐，务必在通风橱操作，佩戴手套护目镜；接触皮肤立即清水冲洗 10 min，不要敞口久放。
3.试剂储存：缓冲液、吸附柱 15-25℃避光保存；DNase I、蛋白酶 K 等 -20℃分装，避免反复冻融；RNase-free 水开盖后 1 个月内用完。
4.离心条件：裂解、结合、漂洗、空甩均室温离心，标准离心力 13400×g；低温易盐析堵柱，降低 RNA 吸附效率。
5.防 RNase 污染（重点）：全部耗材无 RNase、一次性使用；佩戴口罩手套，勿触碰柱膜与管盖；台面用 RNase 灭活剂擦拭；RNA 与 DNA / 蛋白实验分区；样本裂解操作快速，减少内源 RNase 降解 RNA。
1、裂解环节：样本量严格遵循试剂盒上限，过量样本会超出硅膜吸附容量，同时裂解液不足以完全抑制内源 RNase；不足则产量偏低。
2、结合步骤：无水乙醇体积严格匹配上清比例，比例失衡会导致 RNA 无法吸附或大量杂质共吸附。
3、漂洗两步不可省：两次漂洗液洗涤，依次去除蛋白、盐、多糖多酚抑制物；漂洗后 13400×g 空甩 2min 彻底除乙醇残留，乙醇会完全抑制反转录、荧光定量 PCR。
4、洗脱优化：洗脱液垂直滴加硅胶膜正中央，室温静置 5min 再离心；低产量样本可收集滤液二次洗脱，提升总 RNA 收获量。
5、RNA 保存：提取完成立即分装，-80℃长期储存，-20℃短期不超过 7 天；避免反复冻融，建议提取后 24h 内反转录为 cDNA 保存，稳定性大幅提升。
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常见问题 |
原因分析 |
解决方案 |
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RNA 降解 |
实验用品未灭活 RNA 酶 |
按说明书要求准备各项实验用品 |
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样本拿来后未及时处理 |
样本及时处理或保存在液氮或 - 70℃ |
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RNA 提取过程较慢，发生降解 |
实验在冰上进行，低温离心，快速操作 |
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RNA 提取后未冷冻保存 |
若不是立即使用，需保存在 - 70℃ |
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基因组 DNA 残留 |
样本量超出了试剂处理范围 |
根据样本选择合适的试剂使用量 |
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吸取上清时吸入了中间相 |
可用量程小的移液枪少量多次吸取 |
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样品含有机试剂、强缓冲液等 |
漂洗过程中尽可能去除此类物质 |
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RNA 产量低 |
样本裂解或匀浆不彻底 |
液氮充分研磨，加入裂解液可剧烈震荡 |
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组织本身 RNA 含量少 |
可适当提高样本起始处理量 |
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样本量超过吸附柱的吸附能力 |
可使用多个吸附柱，洗脱后收集到一起 |
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去蛋白液和漂洗液忘记加乙醇 |
初次使用，需检查试剂是否可使用 |
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样本在 - 20℃或 - 70℃存放太久 |
存放时间长会降低 RNA 产量，应尽快处理样本，提取时可适当多加样本 |
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OD260/OD280＜1.6 |
溶解 RNA 时未用 TE 而用了水 |
应按要求用 TE 缓冲液溶解 RNA |
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有蛋白或苯酚残留污染 |
吸取上清时避免吸到中间层和有机层 |
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下游的 RT-PCR 实验不成功 |
有乙醇残留，抑制反应 |
漂洗离心后，开盖几分钟，让乙醇挥发 |
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有多糖多酚抑制物残留 |
选择合适的 RNA 提取试剂盒去除多糖多酚 |
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RNA 提取过程中有降解 |
实验在冰上进行，低温离心，快速操作 |
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提取后未在 - 20℃或 - 70℃保存 |
尽可能将 RNA 保存在 - 70℃ |
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