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一、质粒提取通用关键注意事项
（一）裂解阶段（P1、P2、P3 操作最容易出错）
1. P1 重悬：菌体沉淀必须彻底打散，无细小菌块残留；菌块没打散会裂解不完全，质粒释放量大幅减少。
2. P2 裂解：轻柔颠倒混匀 5~6 次即可，裂解时间严格控制≤5 min； 碱性环境放置太久，NaOH 会断裂基因组 DNA，造成 gDNA 污染质粒；禁止涡旋震荡。
3. P3 中和：加入中和液后轻柔颠倒混匀，出现白色蛋白沉淀（菌体蛋白 + 基因组复合物），离心充分沉淀蛋白，吸取上清时千万不要吸到白色沉淀，否则蛋白、gDNA 会污染质粒。
（二）核酸吸附、洗涤阶段
1. 上清过柱离心：质粒在高盐环境下结合硅胶膜，废液全部倒掉；
2. 漂洗液 PW 洗涤 2 次：彻底去除盐分、SDS、蛋白杂质； 漂洗液含乙醇，洗涤后必须空柱高速离心 2~3 min，彻底挥发柱内残留乙醇；乙醇残留会抑制后续酶切、PCR、转染等下游实验。
（三）洗脱收集质粒 DNA
1. 洗脱缓冲液 EB（或无菌超纯水）pH 偏碱性（pH8.0~8.5）最利于 DNA 洗脱；纯水洗脱效率略低于 EB；
2. 洗脱液加在硅胶膜中央，室温静置 2~5 min 再离心，能显著提高洗脱得率；
3. 洗脱体积按需调整：小体积洗脱（30~50 μL）质粒浓度更高，大体积浓度偏低。
（四）试剂整体保存
P1（含 RNase A）：4℃保存；
P2 强碱溶液：极易吸收空气中 CO₂被中和失效，必须拧紧瓶盖室温避光存放；
P3、漂洗液、平衡液：室温保存即可。
（五）下游实验适配要点
用于细胞转染：需要选用无内毒素质粒提取试剂盒；
普通克隆、酶切、PCR：常规质粒提取即可满足需求。
二、试剂盒提取注意事项
1. 溶液 P1（重悬液）RNase A 添加与保存
首次启用试剂盒，要把整支 RNase A 全部加入溶液 P1，混匀后终浓度达到 100 μg/mL，4℃冷藏存放； RNase A 作用：降解菌体总 RNA，避免 RNA 污染质粒 DNA。若酶失活，最终质粒样品会混杂大量 RNA，电泳会出现弥散杂带、260/280 比值异常偏高，补救方式：直接向 P1 里补加足量 RNase A。 严禁室温长期放置加了 RNase A 的 P1，酶容易失效。
2. 溶液 P2（裂解液，含 SDS+NaOH）低温析出问题
P2 里的 SDS（十二烷基硫酸钠，表面活性剂）温度偏低时会凝固、析出白色沉淀，液体浑浊； 处理：37℃水浴温热数分钟，待完全澄清即可使用； 禁忌：不要剧烈震荡摇晃，会产生大量泡沫，容易造成基因组 DNA 断裂，引发质粒污染基因组 DNA。
质粒产量影响因素 最终提质粒得率，主要取决于 3 点： ① 大肠杆菌菌体收集量（菌液 OD₆₀₀最佳 0.6~1.0，过老菌体自溶、产量下降）； ② 质粒拷贝数：高拷贝质粒（pUC 系列）产量远高于低拷贝质粒； ③ 菌体培养条件（摇床转速、温度、抗生素筛选是否有效）。
3. 离心温度要求 全套离心步骤统一在室温 15~25℃操作； 低温会导致 SDS、盐类析出，影响核酸吸附硅胶柱效率，降低质粒回收率。
吸附柱 AC 平衡预处理步骤使用吸附柱前必须平衡：向吸附柱内加入 100 μL 平衡液，13400×g 离心 1 min，弃废液； 作用：活化硅胶膜基团、调节柱内 pH 环境，大幅提升质粒 DNA 结合效率，提升最终得率。
三、样本适用试剂盒类型
样本
货号
提取量
菌液处理量
溶液型
离心柱型
内毒素清除
大肠杆菌
AD0101
小提
1-5ml
√
AD0102
小提
1-5ml
√
AD0103
小提
1.5-4.5mL
√
√
AD0104
小提中量
5-15ml
√
AD0105
小提中量
5-15ml
√
√
AD0107
小提中量
5-15ml
√
√
AD0201
中提
50-70ml
√
√
AD0302
大提
150-300mL
√
AD0303
大提
150-300mL
√
√
AD0304
大提
150-200 mL
√
√
AD0305
大提
150 mL
√
√
AD0306
大提
100-300 mL
√
√
酵母
AD0401
大提
1.5-5mL
√
AD0501
大提
100-180mL
√
四、常见问题及解决方案参考
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常见问题 |
原因分析 |
解决方案 |
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质粒提取未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ |
大肠杆菌老化 |
涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 |
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质粒拷贝数低 |
由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体 |
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菌体中无质粒 |
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确 |
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碱裂解不充分 |
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量 |
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溶液使用不当 |
溶液 P2 和溶液 P3（溶液 N3）在温度较低时可能出现浑浊，应置于 37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用 |
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吸附柱过载 |
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如 TB 或 2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少 LB 培养液体积 |
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质粒未全部溶解（尤其质粒较大时） |
洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间 |
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乙醇残留 |
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液 |
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洗脱液加入位置不正确 |
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率 |
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洗脱液不合适 |
DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液 EB（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5）或水。洗脱效率还取决于 pH 值，最大洗脱效率在 pH7.0~8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果 pH 过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至 60℃后使用，有利于提高洗脱效率 |
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洗脱体积太小 |
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积 |
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洗脱时间过短 |
洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1min 可达到较好的效果 |
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涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ |
涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒 |
建议涂布棒干烧较长时间后，冷却后再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染 |
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原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常？ |
这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中 |
降低培养温度，在 20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率 |
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使用一些特殊菌株，如 Sure 菌株，它缺失了一些重组酶，如 rec 类等，使得质粒复制更加稳定 |
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质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的 NaOH 浓度过高造成的 |
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细菌离心加入溶液 Ⅰ 振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？ |
细菌发生溶菌 |
可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用 PBS 将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些 |
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质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定 |
刚活化的菌比 -80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因 |
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判断生长的菌液是否正常 |
以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒 |
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菌液生长太浓，摇床速度过高 |
菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高，达到 OD600 1.5 就可 |
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