PCR常见问题

PCR技术，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），它不仅能用于DNA分析，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。通过PCR，只需数小时反应就可以将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术，在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。随着生物技术不断发展，除了常规PCR，PCR的大家族新增了RT-PCR、Q-PCR等成员。

常规PCR作为应用最广泛的实验技术之一，深受广大科研工作者的“喜爱”。与体内复杂的DNA复制过程相比，常规PCR反应体系相对简单，在一个PCR反应管中加入模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、ddH2O，即可放入PCR仪器中进行反应。

但是在实验过程中，我们经常会受到无扩增产物（或条带很弱）、非特异性扩增、引物二聚体、条带拖尾、假阳性等诸多问题的困扰，如何解决这些问题呢？且看星博士为您细细分析！

无扩增产物

(1) 试剂、仪器等问题：

解决方式：选择新的试剂、仪器同时实验，对照实验结果，选择效果较好的进行实验。

(2) 引物设计不佳：

解决方式：增加已知可扩增出条带的片段为对照组，排除试剂、仪器等问题后仍然得不到目的条带，需要重新设计引物。

(3) 模板浓度低：

解决方式：重新提取模板DNA，测定模板浓度，保证模板纯度，可以得到更好的实验结果。

(4) 目的产物过长：

解决方式：选择适合长片段扩增的DNA聚合酶。思科捷助力科研，开发了Spark Long Taq DNA Polymerase

产品，扩增基因组长度可达27kb，λ DNA长度可达40kb，延伸速度为1-2 kb/min，是进行长片段PCR的好帮手。

(5) 反应条件：

解决方式：退火温度太高，或延伸时间太短，都可能导致实验失败。可以调整PCR反应程序，设置梯度扩增，选取扩增效果最佳的实验条件。

非特异性扩增

PCR产物的条带与预计的大小不一致，可能是以下原因造成的：

（1）引物特异性差：

解决方式：需要重新设计引物。

（2）反应体系：

模板或引物浓度过高，酶量过多，Mg2+浓度偏高都会产生多种扩增条带。

解决方式：反应体系中各组分的用量并不是越多越好，适合的才是最好的。思科捷助力科研，开发了多种PCR Mix，对DNA聚合酶、Mg2+浓度进行科学配比，省去您的烦恼。

（3）反应条件：

退火温度偏低、循环次数过多都可能会造成非特异性条带的产生。

解决方式：您可以调整PCR反应程序，设置多个对照组优化PCR反应条件，总有一种适合您！

引物二聚体

作为 PCR 的副产物，引物二聚体的存在让人防不胜防，甚至有时候以主要产物的形式存在于反应产物中，了解引物二聚体的成因，能够帮您快速消灭它。顾名思义，引物二聚体是引物与引物聚合的产物，其根本原因是引物之间或者引物自身 3’ 端部分碱基发生了互补结合。

那么要从根本上解决问题，就需要重新设计引物。除此之外，增加模板用量、减小引物浓度、在体系中添加少量的甘油或 DMSO、提高退火温度、减少循环次数也有助于减少引物二聚体的产生。

条带拖尾 

（1）反应体系：

模板不纯、Buffer不合适、退火温度偏低、酶量过多、dNTP、Mg ²⁺浓度偏高

解决方式：优化反应体系中各组分的用量。（思科捷Mix，选我！选我！选我！）

（2）反应条件：

循环次数过多

解决方式：优化反应条件，降低循环次数。

退火温度偏低、循环次数过多都可能会造成非特异性条带的产生。

解决方式：您可以调整PCR反应程序，设置多个对照组优化PCR反应条件，总有一种适合您！

假阳性

当空白对照出现目的扩增产物时，说明您的试剂、模板、引物或实验器材存在污染现象。
      解决方式：重新准备试剂、器材进行实验，必要时换新的环境进行实验，防止气溶胶污染。