每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N+1次的 PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？

今天就给大家详细讲解

一步法快速构建同源重组载体

并且阳性率很高的方式

无缝克隆。

无缝克隆(Seamless Cloning/In-Fusion Cloning)：在载体末端和引物末端应具有16-25个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了16-25个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒(环状)依靠自身酶系将缺口修复。

01传统克隆与无缝克隆的区别

02传统克隆的特点

• PCR 引物设计需引入载体上的酶切位点，PCR 产物再经过酶切、胶回收、连接后定向克隆到目的载体上；

• 需要查找合适的酶切位点，购买各种内切酶；

• 过夜连接，阳性率低；

• 多个片段，通常只能分多次拼接。

03无缝克隆的优势

•不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平末端/粘末端的限制，可以在任意位点进行克隆；

•30 min 即可将一个 50 bp-15 kb 的 PCR 扩增片段（平/A 末端）插入任意载体的任意位置。可同时连接多个 DNA 片段，最多可达 5 个；

•无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列；

•高效、准确，克隆阳性率可达 95%以上。

重点来了

无论你是要做简单的克隆，还是多片段克隆或者突变体克隆，包括载体改造等都可以用到思科捷生物的无缝克隆试剂盒。

线性化载体的制备

l 酶切来源

l 反向PCR来源

插入 DNA 片段的制备

l 克隆引物设计

l PCR扩增，纯化片段

室温配制连接体系（10 μL）

l 轻轻混匀，50℃反应30min。

刚接触无缝克隆的小伙伴可能会遇到一些问题：平板上不长克隆、克隆很少或者是空载体，下面跟大家分享一下解决问题的几个建议。

排查引物设计问题

首先排查引物设计问题，一步法无缝克隆引物设计总的原则是：通过在引物 5'端和 3'端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产 物 5'和 3'最末端分别带有和线性化克隆载体末端对应的完全一致的序列。

同源臂长度：线性载体16-25 nt 重叠区序列（3'末端算起）+插入片段特异引物序列（18-25 nt）。

反应温度：50℃。

反应时间：较短片段（如 100 bp-1 kb）只需 15 min 便可获得足够的转化子，较长片段的连接，可延长反应时间至 60 min。

载体自连改进办法

如果载体线性化不彻底，会发生载体自连，改进办法有以下几点：

✔尽量选择双酶切，酶切时减少质粒投入量，延长酶切时间（无星号活性）。

✔胶回收纯化，做阴性对照验证载体线性化程度。

✔载体和插入片段不纯：建议胶回收纯化。

✔浓度测定准确性：纯化后的片段 A260/A280 约为1.8， A260/A230 大于2.0说明核酸的纯度比较好，如果纯化后片段的纯度不太好，里面的杂质可能会影响克隆效率导致克隆数长得少，针对这种情况建议重新制备插入片段，在纯化时注意提高核酸的纯度。

片段使用量要准确

✔插入片段与载体的摩尔比在 2:1-3:1 之间最佳。插入片段的投入量过高或过低，可能会影响克隆效率，推荐按照说明书上的计算公式进行投入量的计算。

✔如果片段来源于质粒模板，且该质粒与重组载体具有相同抗性，纯化前用 Dpn I 内切酶消化质粒模板，可降低背景，提高阳性率

✔设置阳性对照。

选择合适的感受态

选择合适的感受态，感受态细胞的转化效率需大于107cfu/μg：

✔ 转化体系：转化时，转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。

✔抗生素：排查抗生素有未加错、平板放置时间是否准确。

以上就是针对无缝克隆的

原理介绍和解决方案的推荐。