免疫组化是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。

实验步骤Experimental Procedure

01脱蜡水化：

脱蜡水化：将切片放入切片架中，于烘箱中烘烤进行脱蜡，然后迅速将带有组织切片的切片架按顺序置于二甲苯 I 、二甲苯 II 、二甲苯 III 、无水乙醇I 、无水乙醇 II 、95%乙醇、85% 乙醇、75%乙醇 、50%乙醇中浸泡，最后用超纯水再浸泡。

思科捷实验平台根据客户的样本类型和抗体类型选择不同抗原修复液和抗原修复方式，包括热修复（微波修复、水浴锅修复）和酶修复。下图展现的是微波修复-修复液漫过切片，将烧杯放入微波炉中，高火煮沸改至中火计时 15 min（组织不同、 固定时间不同，修复时间也不同）。

将内源性过氧化物酶封闭液滴加到切片上，室温封闭 10 min 去除内源性过氧化物酶，再用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。

将封闭液（根据二抗决定）滴加到切片上，将切片连同湿盒一起放置于恒温箱中孵育，然后甩去封闭用的封闭液。

滴加按照相应比例稀释的一抗，记录好一抗浓度，将切片放在湿盒中于 4℃冰箱中过夜孵育，过夜孵育后的切片先恢复至室温，再用 PBS清洗。

滴加适当比例稀释的HRP标记的二抗，将切片放在湿盒中进行室温孵育，待孵育结束后，再用 PBS 冲洗。

加入DAB工作液，开始计时。当在显微镜下观察到棕黄色的阳性表达时，立即用PBS缓冲液进行终止显色。

将切片置于玻片存放板上，取过滤后的苏木素滴加到组织切片上，开始计时，待组织切片呈紫红色结束计时，记录染色时间(具体时间视染色结果和实验要求而定)。

染色后立即将存放板置于自来水水槽上进行冲洗，将多余染料冲净，再将盐酸乙醇分化液滴加到组织切片上进行分化，待组织由蓝变红，再用自来水冲洗组织返蓝。

将染色后的切片放于切片架中，按顺序依次置于 50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇浸泡、二甲苯II、二甲苯I中浸泡。

待切片晾干后置于存放板上，在组织上滴加中性树胶封片剂，用盖玻片进行封片，将封好的组织切片放入通风橱中晾至无味。

（1）按照荧光显微镜使用规程进行操作，将切片放于置物台的卡槽里，在50 X 物镜下找到组织所在位置，将物镜调整到客户所需倍数，调好焦距、 调好光亮度。

（2）调白平衡：在拍照位置调清晰后找到有中性树胶封片剂的空白处，进行白平衡。

（3）提取图像：根据客户要求找到目标位置，再次调整焦距至清晰视野，点击提取图像完成拍照。

(1) 在正式实验之前，需进行染色效果预实验摸索，以确定最佳的染色条件。

(2) 自来水冲洗时水流速度要小，并且水流不能直冲组织，避免造成组织脱离玻片或者冲散。

(3) 切片经苏木素复染后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封片，如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。

(4) 抗原修复方式由一抗决定，可以通过抗体说明书或案例中查到，也可以询问抗体公司进行确认。

(5) 一抗孵育后，清洗切片时一定要单张切片，逐个进行冲洗，多张切片用浸泡的方式同时进行清洗，容易造成交叉污染； 温柔冲洗，防止组织的脱落。

关于思科捷

      山东思科捷生物技术有限公司于2017年成立，2018年推出自主品牌“思科捷”，拥有分子生物学、细胞生物学、免疫学、小分子化合物、实验耗材、科学仪器六个系列一万多个单品，并且可为科研工作者提供病理切片、HE染色、特殊染色、免疫组化/免疫荧光、电镜、蛋白及免疫检测、分子生物学检测、理化检测、细胞实验、动物造模、多组学测序以及整体实验等专业技术服务。公司后续将纳入诊断试剂相关产品，并搭建CDMO平台，为制药、生物科技、政府和学术机构客户提供生物制剂研发整体技术服务，真正做到思以科，捷所成！