在细胞生物学与药理学研究中，细胞增殖能力的评估是不可或缺的一环。其中，CCK-8 (Cell Counting Kit) 实验因操作简便、灵敏度高且结果准确可靠而备受青睐。

接下来让星博士带您深入了解 CCK-8 实验的关键要点吧！

CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 的有效成分是 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐) ，是一种类似于 MTT (Thiazolyl Blue) 的化合物，它在电子耦合试剂 1-Methoxy PMS 存在条件下，可被线粒体内的脱氢酶还原为橙色甲瓒产物 Formazan (具有高度水溶性) ，而生成的 Formazan 数量与活细胞数量成正比。

甲瓒产物在 450 nm 波长下有最大的吸光度，因此通常使用酶标仪检测该波长处的吸光度 (OD 值)，OD 值与细胞活力成正比，从而可进行定量分析。

细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

药敏实验，细胞增殖和毒性分析，特别适用于高通量筛选

制备细胞悬液并计数。

可按比例 (如 1:2) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般做 5-7 个细胞浓度梯度，每组设置 3-6 个重复，96 孔板每孔加入 100 μL 细胞悬液。实验设置调零孔，孔内加 100 μL 培养基 (不含细胞)。

培养至细胞贴壁，一般 2-4 小时即可。悬浮细胞或不需贴壁此步骤可省略。

每孔加 10 μL CCK-8 溶液，混匀，培养箱内孵育 0.5-4 小时，测定酶标仪 450 nm 处 OD 值。(细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，绝大多数情况下孵育 1 小时即可。如果显色程度不够，可继续培养以确认最佳条件)。

以细胞数为横坐标 (X 轴) ，OD 值为纵坐标 (Y 轴) 制作标准曲线。在实验条件一致时，可以根据此标准曲线测定出未知样品的细胞数。

制备细胞悬液并计数。

选择合适的铺板细胞数，用培养基稀释细胞悬液，96 孔板每孔加入约 100 μL 细胞悬液，并设置重复 (一般设置 3-6 个重复)。

37 ℃ 培养箱预培养 24 小时。

每孔加 10 μL CCK-8 溶液，混匀，培养箱内孵育 0.5-4 小时，并用酶标仪测定 450 nm 处 OD 值 (细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，在大多数情况下孵育 1 小时即可。如果显色程度不够，可继续培养以确认最佳条件) 。

制备细胞悬液并计数。

选择合适的铺板细胞数，用培养基稀释细胞悬液。实验设置空白孔、对照孔及实验孔，空白孔内加 100 μL 培养基 (不含细胞)，对照孔及加药孔加入 100 μL 相同细胞浓度的细胞悬液，并设置重复 (一般设置 3-6个重复)。

37 ℃ 培养箱预培养 24 小时，或根据实验的不同要求合理调整培养时间。

实验孔内加入 0-10 μL 不同浓度的待测药物。置于培养箱继续孵育一段时间 (例如：6、12、24或 48 小时) ，具体孵育时间要根据药物性质及细胞敏感性 (一般由细胞周期决定，起码要孵育一代以上的时间) 。

每孔加入 10 μL CCK-8溶液 (注意：若待测药物有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8 溶液前吸除培养基并用新的培养基轻轻洗涤细胞两次后再加入新的培养基，以去掉药物影响) ，混匀，继续孵育。培养箱内孵育 0.5-4 小时，用酶标仪测定 450 nm 处 OD 值 (细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，绝大多数情况下孵育 1 小时即可。如果显色程度不够，可继续培养以确认最佳条件)。

细胞抑制率= (对照-实验)/(对照-空白) ×100%

对照：具有细胞、培养基、CCK-8溶液的孔的OD值

实验：具有细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值

空白：具有培养基和CCK-8溶液的孔的OD值

为得到更佳的实验结果，在正式开始实验前，要做什么呢？

星博士为您整理了一些注意事项，请和星博士一起往下看吧：

(1) 先做预实验：

建议在实验前进行预实验，以确定最佳的细胞接种数量和 CCK-8 溶液加入后的最佳培养时间

(2) 注意液体蒸发：

一般使用 96 孔板进行检测，但如果细胞培养时间较长，可能出现液体蒸发的情况。而96孔板外围一圈最易蒸发，可弃用，改加 PBS，水或无血清培养基。同时，可以将孔板放置在培养箱内靠近水源的位置，以减少液体蒸发。

(3) 试剂颜色不影响结果：

虽然培养基中的酚红和 CCK-8 溶液颜色相近，但是在计算时，培养基中酚红的吸光度可通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

(4) 24孔板和12孔板均适用：

若使用 24 孔板或 12 孔板实验，可按孔内培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

(5) 去除氧化还原物质的影响：

如果待测体系中存在氧化还原物质可能会干扰检测结果，还原性物质会使吸光度增加，氧化性物质会使吸光度减小，因此需要尽量去除这些物质的影响。

(6) 滤光片的选择：

若没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但是450 nm检测灵敏度最高。如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长 450 nm，参比波长600-650 nm 。

(7) 加试剂小tip：

由于每孔加 CCK-8 溶液的量比较少，有可能因试剂粘在孔壁带来误差，可以加过试剂后轻敲混匀或直接配置含有 10% CCK-8 溶液的培养基，以换液形式加入。操作时注意不要产生气泡，气泡会影响最后的测定结果。

(8) 设置空白对照：

设置空白孔作为调零孔时，在不含细胞的培养基中加入CCK-8 溶液，培养相同时间后以在 450 nm 处测定的吸光值作为空白对照。

在处理细胞时加入药物，还应考虑药物的吸收。为此，可以在加入药物的培养基中添加 CCK-8 溶液，并在培养相同时间后，在 450 nm 处测定吸光值作为空白对照。

PS：货号 CT0001，有100T；500T；500T*5；500T*20；500T*50多种规格哦!